چاپ صفحه |  صفحه نخست سامانه |  نویسندگان |  اطلاعات تفضیلی |  دانلود مقاله | علوم پزشکی کرمانشاه |
| نویسنده | نفر چندم مقاله |
|---|---|
| سمیه تدینی لهی | اول |
| عنوان | متن |
|---|---|
| کلمات کلیدی | Melatonin, Retinoic acid, In-vitro maturation, Immature oocytes, Embryonic development, Maturation rate, Mouseکلید واژهها : ملاتونین ، رتینوئیکاسید ، بلوغ رویان ، بلوغ تخمک ، لقاح آزمایشگاهی ، تخمک نارس |
| چکیده | Abstract Background and Objective: With respect to the antioxidant role of melatonin and retinoic acid, it seems to be effective both in the maturation and embryonic development. This study was done to investigate the effect of combination of melatonin and All-Trans retinoic acid (RA) on maturation, fertilization and embryonic development of immature mouse oocytes. Methods: In this experimental study, cumulus - oocyte complex (COCs) were recovered from 4-6 week old female mice NMRI and were divided into 6 maturation medium groups including control, sham, experiment 1(melatonin 100 nM, 1 and 2 µM), experiment 2 (retinoic acid 1, 2, 4, 6 µM), experiment 3 (melatonin 2 µM+RA 4 µM), experiment 4 (Mel 100nM + retinoic acid 4µM). The maturation rate was recorded after 24 hours of culture in a humidified atmosphere of 5% CO2 at 37°C. The matured oocytes were fertilized with sperm. Fertilization and embryonic development rates to the blastocyst stage were recorded. Results: Maturation rate in the control and sham groups were 50.6% and 49.4%, espectively. Maturation rate were 54.3%, 54.8%, 59.9% in melatonin group with concentrations of 100 nM, 1 and 2 µM, respectively. Maturation rate were 51.6%, 51%, 59% and 49.6% in t-RA group with concentrations of 1, 2, 4, 6 μM. Maturation rate were 60.4% and 54.2% in the experiment 3 and 4 groups, respectively. The maturation rates in the melatonin 2 µM, retinoic acid 4 µM and experiment 3 significantly increased in compare to control (P<0.05). The embryonic development rate in the melatonin with 100nM concentration and 4 µM of retinoic acid increased significantly compared to controls (P<0.05). Although, embryonic development rate in experiment 3 was higher than control, but lower in compare to melatonin 100 nM and the retinoic acid 4 µM. The embryonic development rate in experiment 4 significantly increased in compare to control (P<0.05). Conclusion: Combination of melatonin and All-Trans retinoic acid in medium culture increase maturation rate and improved embryonic development in dose dependent mannerچکیده زمینه و هدف : با توجه به نقش آنتیاکسیدانی ملاتونین و رتینوئیکاسید بهنظر میرسد این دو در میزان بلوغ و تکوین رویانی موثرنـد. این مطالعه به منطور تعیین اثر توأم ملاتونین و آل- ترانس رتینوئیکاسید بر بلوغ، لقاح و تکوین رویانی تخمکهای نارس موش در شـرایط آزمایشگاهی انجام گردید. روش بررسی : مجموعه تخمک- کومولوس ) (COCsاز تخمدان موشهای ماده نژاد NMRIجمعآوری شـدند و بـهطـور تصـادفی در محیط کشت بلوغ در شش گروه قرار گرفتند. گروههـا شـامل کنتـرل، شـم، آزمـون) 1ملاتـونین در غلظـتهـای 100نـانومولار، 1و 2 میکرومولار(، آزمون ) 2رتینوئیکاسید در غلظتهـای 4 ، 2 ،1و 6میکرومـولار(، آزمـون ) 3ملاتـونین 2میکرومـولار و رتینوئیـکاسـید 4میکرومولار( و آزمون ) 4ملاتونین 100نانومولار و رتینوئیکاسید 4میکرومولار( بودند. بعد از 24ساعت تخمکهای بالغ با اسـپرم لقـاح داده شدند و تکوین رویانی تا مرحله بلاستوسیست به مدت پنج روز بررسی شد. یافتهها : میزان بلوغ تخمکها در گروه کنترل 50/6درصد و در گروه شم 49/4درصد بود و بین دو گروه اخـتلاف آمـاری معنـیداری مشاهده نشد. در گروه ملاتونین با غلظتهای 100نانومولار، 1و 2میکرومولار به ترتیب 54/3درصد، 54/8درصد و 59/9درصد، در گروه رتینوئیکاسید با غلظتهای 6،4،2،1میکرومولار به ترتیب 51/6درصد، 51درصد، 59درصد و 49/6درصـد و در گـروه 3و 4تـوأم بـه ترتیب 60/4درصد و 54/2درصد بود. میزان بلوغ تخمک در گروه 2میکرومولار ملاتونین، گروه 4میکرومولار رتینوئیکاسید و در گروه 3 توأم نسبت به گروه کنترل افزایش آماری معنیداری داشت ) .(P<0/05میزان تکوین در گـروه ملاتـونین در غلظـت 100نـانومولار، گـروه رتینوئیکاسید در غلظت 4میکرومولار و گروه 4توأم نسبت به گروه کنترل افزایش آماری معنیداری داشت ) .(P<0/05گرچه میزان تکوین در گروه 3توأم نسبت به گروه کنترل بیشتر بود؛ اما نسبت به غلظت 100نانومولار ملاتونین و 4میکرومولار رتینوئیکاسـید کـه بـه تنهـایی استفاده گردید؛ کمتر بود. نتیجهگیری : اضافه کردن ملاتونین و آل-ترانس رتینوئیکاسید با هم به محیط کشت بلوغ، سبب افزایش بلوغ و بهبود تکوین جنینهای حاصل از آنها به صورت وابسته به دوز میشود. کلید واژهها : ملاتونین ، رتینوئیکاسید ، بلوغ رویان ، بلوغ تخمک ، لقاح آزمایشگاهی ، تخمک نارس. |
| متن مقاله | مقدمه (Assisted Reproductive Technologies) در روشهای کمـک بـاروری ) (ARTاغلب پروتکل تحریک تخمکگذاری، بـه منظـور افـزایش تعداد تخمکهای موجود برای لقاح مورد استفاده قـرار مـیگیـرد و در بعضی از بیماران منجر به سندرم تحریک بـیش از حـد تخمـدانی .( مـیشـودOvarian Hyper Stimulation Syndrome: OHSS) روش بلـوغ آزمایشـگاهی تخمـک )(In Vitro Maturation: IVM یک تکنیک جایگزین و امیدبخش برای بلوغ تخمکهای نابـالغ در شرایط آزمایشگاهی در مورد برخی از بیماران از جمله آنانی کـه در معرض OHSSهستند؛ میتواند بهکار رود ) .(1تفـاوت عمـدهای درسمیه تدینی لهی و همکاران / 47 مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی گرگان / پاییز / 1394دوره / 17شماره ) 3پی در پی (55 بلوغ هستهای و یا لقـاح و میـزان کلیـواژ تخمـکهـای بـالغ شـده در in vivoبا تخمکهای بالغ شده در شرایط آزمایشگاهی دیده نشـده است؛ اما میزان بارداری در شـرایط آزمایشـگاهی بسـیار پـایینتـر از in vivoاست ) .(2از جمله عوامـل مـوثر بـر ظرفیـت رشـد ضـعیف تخمک در شرایط آزمایشگاهی میتوان بـه مطلـوب نبـودن شـرایط محـیط کشـت در طـول IVMو عـدم بلـوغ سیتوپلاسـمی کـافی در مقایسه با بلوغ هستهای اشاره کـرد ) .(2بـه ایـن دلیـل بهبـود شـرایط کشت برای موفقیت بیشتر در بلوغ تخمک )هم سیتوپلاسـمی و هـم هستهای( ضروری است تا منجر به بهبود پتانسیل تولید آزمایشـگاهی جنین شود ) .(3همچنین کشت در شرایط آزمایشگاه جنـینهـا را در معرض عوامل اکسیداتیو مختلفی قرار میدهد. از جملـه ایـن عوامـل (Reactive Oxygen Species: ROS) گونههای واکنشپذیراکسیژن هستند که خود شامل هیدروژن پراکسید ) ،(H2O2آنیـون پراکسـید ) ،(O2رادیکال هیدروکسید ) (OHاست ) .(4این عوامل اکسـیداتیو در اووسیت موجب پراکسـیده شـدن لیپیـد غشـا و آسـیب بـه DNA مـیشـوند و مـیتواننـد اثـرات نـامطلوبی در تقسـیم سـلولی، انتقـال متابولیــت و عملکــرد میتوکنــدری داشــته باشــند. از ایــن رو ROS مـیتوانـد پیـری اووسـیت را شـتاب دهـد و منجـر بـه کیفیـت پـایین اووسیت شود ) .(5در حالـت طبیعـی درون فولیکـولهـا آنـزیمهـای آنتیاکسیدانی از قبیل ،(SOD) Superoxide dismutaseگلوتـاتیون پراکســــیداز ) ،(Glutathione peroxidase: GPxکاتــــالاز و آنتیاکسیدانهای غیرآنزیمـی از قبیـل ویتـامین Eو Cو گلوتـاتیون، اوریک اسید، آلبومین، ملاتونین و رتینوئیکاسید حضور دارند ).(6 در زنان با ناباروری ناشناخته، کاهش سطح آنزیمی آنتیاکسیدانهـا از قبیل GPxگزارش شده است )5و .(7بنـابراین یـک راه محافظـت اووسـیتهـا از عوامـل اکسـیداتیو، مکمـل نمـودن محـیط کشـت بـا ترکیبات آنتیاکسیدان است ).(6 ملاتونین ) –Nاسیل 5متوکسی تریپتامین( یک مشتق اینـدولامین است )4و (8که در مهرهداران از قبیل انسان، علاوه برغده پینـهآل در شبکیه، پوست و دسـتگاه گـوارش سـنتز مـیشـود ) .(8ملاتـونین در تخمدان نیز سنتز میشود و به درون مایع فولیکولی ترشح مـیگـردد ) .(8مایع فولیکولی پیش از تخمکگذاری انسان غلظـت بـالاتری از ملاتــونین را نســبت بــه پلاســما دارد و غلظــت ملاتــونین در مــایع فولیکولی وابسته به رشد فولیکول افزایش مییابد ) .(8ملاتـونین هـم در آب و هــم در چربــی قابــل حــل اســت و بــهصــورت یــک آنتـیاکســیدان هیـدروفیلیک و هیــدروفوبیک عمـل مــیکنــد ).(4 ملاتونین اگـزوژن اثـرات مفیـدی در بلـوغ هسـتهای و سیتوپلاسـمی اووسیتهای گاو ) (9و موش ) (10دارد. ملاتونین مـیتوانـد توقـف جنـینهـا در مرحلـه دو سـلولی را کـاهش و میـزان بلاستوسیسـت را افزایش دهد. بنـابراین ملاتـونین ممکـن اسـت در مراحـل خاصـی از تکــوین رویــانی اولیــه بــرای تحریــک تشــکیل بلاستوسیســت در متابولیسم دخالت داشته باشد ).(10 رتینوئیدها خـانواده بزرگـی از ترکیبـات طبیعـی و خویشـاوند بـا ویتامین Aهستند ) .(11نتایج چندین مطالعـه در گونـههـای مختلـف انجام شده هـم در in vivoو هـم در شـرایط آزمایشـگاه نشـان داده القای رتینوئیدها ممکن است در رویدادهای اولیه تولید مثلی از قبیل توسعه فولیکولی، بلوغ اووسیت و تکـوین رویـانی اولیـه مـوثر باشـد )3و10و .(11رتینوئیــکاســید مــیتوانـــد میــزان بلــوغ و میـــزان بلاستوسیســـت را افـــزایش داده ) (12و در جلـــوگیری از اســـترس اکسیداتیو در سلول نقش داشته باشد ) .(3اثر سودمند ویتامین Aطی رشد اووسیت در شرایط in vivoبا اضافه کردن مشتقات رتینـول بـه سیستم کشت آزمایشگاهی اووسـیتهـایی متوقـف شـده در مرحلـه میوز، بهدست آمده است ) .(3رتینوئیکاسید روی سلولها از طریـق تشکیل یا تغییر الگوی فعالیـت ژن عمـل مـیکنـد و مـیتوانـد بلـوغ سیتوپلاسمی و ظرفیت تخمک را برای پیشرفت در رشد و نمو تحت تأثیر قرار دهد ).(13 بـا توجـه بـه نقـش ملاتـونین و رتینوئیـکاسـید در جلـوگیری از استرسهای اکسیداتیو و بلوغ و ظرفیتگیری تخمـک )6و(14-17؛ گرچه محققین اثر هر یک از این مواد را به طور جداگانـه بـر میـزان بلوغ و تکوین رویانی اولیه در گونههای مختلف گزارش کـردهانـد؛ امـا اثـرات تـوأم ملاتـونین و آل-تـرانس رتینوئیـکاسـید در محـیط کشت بلوغ بر میزان بلوغ تخمـک نـارس و تکـوین رویـانی تـاکنون بررسـی نشـده اسـت. ایـن مطالعـه بـه منظـور تعیـین اثـر ملاتـونین و آل- ترانس رتینوئیک اسید روی بلوغ، باروری و تکوین جنینی قبـل از لانهگزینی تخمکهای نابالغ موش در محیط آزمایشـگاهی انجـام شد. روش بررسی این مطالعه تجربی در آزمایشگاه گروه علوم تشـریحی دانشـکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی مازنـدران در سـال 1392انجـام شـد. همه مـواد مـورد اسـتفاده از شـرکت Sigmaتهیـه گردیـد. پروتکـل اخلاق پژوهشی کار بر روی حیوانات پس از کسب مجوز از کمیتـه مربوطه در دانشگاه رعایت شده است. جمعآوری تخمکهای نابالغ موش از 115سـر مـوش مـاده سـوری نـژاد NMRIبـا سـن 4-6هفتـه نگهداری شده در حیوانخانه با شـرایط اسـتاندارد ) 12سـاعت نـور - تاریکی( استفاده شد. موشها از طریق جابجـایی مهـرههـای گردنـی کشته شدند و تخمدانهای آنها در شرایط حتـیالمقـدور اسـتریل از بـــدن خـــارج و بـــه درون قطـــرات 300میکرولیتـــری محـــیط HTF hepesدار حـاوی 5درصـد FCSمنتقـل شـد و بـا اسـتفاده از سرنگ انسولین زیر لـوپ تشـریح شـد. چربـیهـای اضـافی اطـراف / 48اثر توأم ملاتونین و آل- ترانس رتینوئیکاسید بر بلوغ، لقاح و تکوین رویانی تخمکهای نارس موش مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی گرگان / پاییز / 1394دوره / 17شماره ) 3پی در پی (55 تخمدان حذف شـد و تخمـکهـای نابـالغ در مرحلـه وزیکـول زایـا (Cumulus- ( همراه با سلولهـای کومولـوسGerminal vesicle:GV) ) Oocyte Complex: COCsآزاد شــدند. ســپس بــه درون قطــرات200 (Minimal Essential Medium-Alpha, میکرولیتری محیط کشـت ) MEM-αانتقــال یافتنــد. بــا میکروســکوپ معکــوس مجموعــه کومولوس- تخمکهای دارای سیتوپلاسم یکنواخت با سـلولهـای پوشیده از کومولوس، تخمکهای نارس هستهدار بـا انـدازه تقریبـی 60-65میکرون و سیتوپلاسم روشن با فضای پـیش زردهای مناسـب برای بلوغ آزمایشگاهی مورد استفاده قرارگرفت و بهطور تصادفی به گـــروههـــای کنتـــرل و آزمـــایش تقســـیم شـــدند و در قطـــرات 50میکرولیتــری محــیط کشــت )در هــر قطــره 10-15تخمــک( قرارگرفتند و در دیشهای 1560میلیمتری، کشت داده شدند. طراحی گروهها برای کشت بلوغ تخمک تخمکهای نابالغ ) (GVبا کومولوس جمعآوری شـده از مـوش بهطور تصادفی به گروههای آزمایشی زیـر اختصـاص داده شـد و بـه مدت 20-24سـاعت در انکوبـاتور 37درجـه سـانتیگـراد بـا CO2 5درصد )ساخت آلمان( در داخل قطرات در زیر روغن کشـت داده شدند. سپس با روش پیپت کردن، سلولهای کومولوس اطراف آنها برداشته شد و با میکروسکوپ معکوس )ساخت آلمان( مراحل بلوغ آزمایشگاهی و از سرگیری میوز در تمـامی گـروههـا بررسـی شـد و تخمکهای بالغ لقـاح داده شـدند و تکـوین رویـانی در آنهـا مـورد بررسی قرار گرفت. تعیین بلوغ تخمکها تخمکهای بدون تغییر شکل در هسته )وجـود غشـا دور هسـته( به عنوان تخمـکهـای نابـالغ، تخمـکهـای بـا هسـته شکسـته شـده )پراکنده شدن هسته و متـراکم شـده کرومـوزومهـا( و نشـانه شـروع ( وGerminal Vesicle Break down: GVBD) تقسیم میوز را بـه عنـوان تخمکهای حاوی اولین جسـم قطبـی بـه عنـوان تخمـکهـای بـالغ ) (MIIشناسایی شـدند. حـداقل 6تکـرار جمـعآوری تخمـکهـای نارس و کشت آنها برای هر گروه انجام شد )17و.(18 گروهبندی گــــروه کنتــــرل: محــــیط کشــــت پایــــه حــــاوی ،MEM-α .درصد5 FCS وHCG 7/5mIU/ml ، rFSH 100mlIU/ml گروه شم: محیط کشت پایه+ 0/2درصد ) (v/vاتانل مطلق. گروه آزمون :1محـیط کشـت پایـه + ملاتـونین در غلظـتهـای .2µM و1 ،100 nM گــروه آزمــون :2محــیط کشــت پایــه + رتینوئیــکاســید در غلظتهای 4،2،1و .6 µM گــروه آزمــون :3محــیط کشــت پایــه تــوأم بــا ملاتــونین و رتینوئیکاسید ) Mel 2µMو .(RA 4µM گــروه آزمــون :4محــیط کشــت پایــه تــوأم بــا ملاتــونین و رتینوئیکاسید ) Mel 100nMو .(RA 4 µM برای حل کردن ملاتونین و آل– ترانس رتینوئیکاسید از اتـانول خالص استفاده شد که مقدار آن در محیط کشـت بلـوغ 0/2درصـد بود و هیچ اثر زیانآوری روی گسترش کومولوس و وضعیت هسـته نداشت ).(17 لقاح و تکوین تخمکهای بلوغ یافته موشهای نر نژاد NMRIبـه روش جابجـایی مهـرههـای گردنـی کشته شدند. دم اپیدیدم آنها جدا شد و به قطـرات 500میکرولیتـری محیط کشت T6حاوی 15میکروگـرم در میلـیلیتـر سـرم آلبـومین ( منتقـل شـدند. سـپسAlbumin, BSA Bovine Serum) گـاوی نمونهها به مدت 1-1/5ساعت در انکوبـاتور 37درجـه سـانتیگـراد حاوی 5درصد CO2انکوبه شدند. اسپرمهای فعال با تحرک بالا بـه کنارههای قطره مهاجرت کردند. با انتقال اسپرمهای سـالم و فعـال از کنارههای قطره به داخل قطرات T6حاوی 15میلیگرم در میلیلیتر 1×106) BSAاسپرم درهر میلیلیتر( 5عدد تخمک بالغ در هر قطـره قــرار داده شــد و در انکوبــاتور قــرار گرفــت. پــس از 4-6ســاعت انکوباسیون، اسپرمهای اطـراف تخمـکهـا در سـه قطـره محـیط T6 شسته شدند و از نظر تشکیل پرونوکلئوسهـا در زیـر میکروسـکوپ معکــوس کنتــرل شــدند. زیگــوتهــای پــیش فــرض بــه قطــرات 50میکرولیتر محیط کشت T6حاوی 4میلیگرم در میلیلیتـر BSA در زیر روغن منتقل شدند. وضعیت جنینها تا روز ششم بعد از لقاح به وسیله میکروسکوپ معکـوس بـرای ثبـت مراحـل تکـوین جنـین مشاهده و ثبت شد. جنینهـای دژنـره شـده از محـیط خـارج شـدند. جنینهای متوقف شده به قطرات دیگرمنتقل و در محیط خـود بـاقی مانده و جنینهای سالم تا رسیدن به مرحلـه بلاستوسیسـت در محـیط خود باقی ماندند و در نهایت مورد بررسی قرار گرفتند. ثابت کردن )فیکس( تخمکها بعد از 24ساعت بلوغ، تعـدادی از تخمـکهـایی کـه بـه وسـیله پیپتاژ از سلولهای کومولوس عاری شدند؛ روی لام قرار داده شدند و با لامل مونته شدند. سپس در محلول اسیداستیک و اتانل به نسـبت 1به 3برای حداقل 24ساعت فیکس شدند. تخمکهـا بـا اورسـئین یــک درصــد کــه در 45درصــد اســتیک اســید حــل شــده بــود؛ رنگآمیزی شدند و لامها زیر میکروسـکوپ فـاز کنتراسـت از نظـر بلوغ تخمک بررسی گردید ).(19 تجزیه و تحلیل آماری دادهها با استفاده از نرمافزار آماری SPSS-16بهصـورت درصـد میانگین و انحراف معیار درآمد توصیف شـدند. بـرای درصـد بلـوغ تخمــک، میــزان لقــاح، میــزان کلیــواژ و بلاستوسیســت ازآزمــون کایاسکوئر استفاده شد. هر آزمایشی حداقل شش بار تکـرار شـد وسمیه تدینی لهی و همکاران / 49 مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی گرگان / پاییز / 1394دوره / 17شماره ) 3پی در پی (55 مقادیر کمتر از 0/05معنیدار تلقی شد. یافتهها بلوغ تخمک و تکوین در گروه ملاتونین از مجمــوع 1485تخمــک نــارس بــه دســت آمــده، میــزان تخمکهای باقیمانـده در مرحلـه GVدر گـروههـای کنتـرل، شـم و ملاتونین در غلظتهای 100نانومولار، 1و 2میکرومـولار بـه ترتیـب 9/4درصد، 9/6درصد، 9/1درصد ، 8/4درصد و 8درصـد تعیـین شد. گرچه نسبت به سایر غلظتها در غلظـت 2میکرومـولارکمتر و در غلظت 100نانومولار بیشتر بود؛ اما اختلاف آماری معنیدار نبود. میـزان تخمـکهـای GVBDدر گـروه کنتـرل، شـم و ملاتـونین در غلظتهای 100نانومولار ، 1و 2میکرومولار به ترتیب 28/3درصد، 28/7درصد، 26/6درصد، 24/2درصد و 23/5درصد تعیـین شـد. گرچه در غلظـت 100نـانومولار از سـایر غلظـتهـا بیشـتر بـود؛ امـا اختلاف آماری معنیدارنبود. در ایـن مطالعـه در مقایسـه بـین گـروه کنترل و شم در تمامی مراحل بلوغ، لقاح و تکوین اخـتلاف آمـاری معنیداری مشاهده نگردید. میـزان بلـوغ تخمـک در گـروه کنتـرل، شـم و در غلظـتهـای 100نانومولار، 1و 2میکرومولار ملاتونین بـه ترتیـب 50/6درصـد، 49/4درصـد، 54/3درصـد، 54/8درصـد و 59/9درصـد بـهدسـت آمد. این مقادیر در غلظت 2میکرومولار نسبت به گروههای کنتـرل ) (P<0/02و شم ) (P<0/01افزایش آماری معنیداری نشان داد؛ امـا در غلظت 100نانومولار اختلاف آمـاری معنـیداری مشـاهده نشـد. همچنین درصد تخمکهای دژنره در غلظت 2میکرومولار نسبت بـه دیگر گروهها به طور غیرمعنیداری کمتر بود )نمودار یک(. نتایج لقاح، کلیواژ و تکوین جنـینهـای حاصـل از تخمـکهـای گروه ملاتونین نشان داد؛ گرچه درصد جنینهای مرحله 2سـلولی و بلاستوسیست در غلظت 2میکرومولار نسبت به سایر غلظتها کمتر و نسبت به کنترل و شم بیشتر است؛ اما اخـتلاف آمـاری معنـیداری بهدست نیامد. در غلظت 100نانومولار درصد جنینهای 2سلولی در مقایسه با کنترل ) (P<0/05و شم ) (P<0/02افزایش آماری معنیدار داشت و نیز درصد بلاستوسیست در مقایسـه بـا کنتـرل ) (P<0/02و شم ) (P<0/0001افزایش آماری معنیداری داشتند و این تفـاوتهـا در مقایسه با سایر غلظتهای ملاتـونین اخـتلاف آمـاری معنـیداری نشان نداد. همچنین در مرحله کلیواژ اختلاف آماری معنیداری بـین غلظتهای مختلف با گروه کنترل و شم مشاهده نگردید )نمودار.(2 بلوغ تخمک و تکوین در گروه رتینوئیکاسید از مجموع 1789تخمک نارس بهدست آمده، میزان تخمکهای باقیمانده در مرحله GVدر گروه کنترل، شم و غلظتهـای 1،2،4و6 میکرومولار رتینوئیکاسید به ترتیـب 9/4درصـد، 9/6درصـد، 9/3 درصد، 10/7درصد، 7/3درصد و 7/7درصد تعیین شد. گرچه این نمودار : 1مقایسه نسبت تخمکهای باقیمانده در مرحله ، GVدرصد تخمکهای ،GVBDدرصد بلوغ تخمک و درصد تخمکهای دژنره شده موش در گروههای کنترل، شم و غلظتهای مختلف ملاتونین * اختلاف با گروه کنترل )(P<0/02 # اختلاف با گروه شم )(P<0/01 نمودار : 2مقایسه نسبت جنینهای مرحله 2سلولی، مرحله کلیواژ و بلاستوسیست در گروه ملاتونین نسبت به گروه کنترل و شم * اختلاف با گروه کنترل ) #،(P<0/05اختلاف با گروه شم ) £،(P<0/02اختلاف با گروه کنترل )(P<0/02 € اختلاف با گروه شم )(P<0/0001 میزان نسبت به دیگر گروهها در غلظت 4میکرومولار کمتر و در غلظـت 2میکرومـولار بیشـتر بـود؛ امـا اخـتلاف آمـاری معنـیداری مشاهده نشد. درصد تخمکهـای GVBDدر گـروه کنتـرل، شـم و غلظـتهـای 1،2،4و 6میکرومـولار بـه ترتیـب 28/3درصـد، 28/7 درصد، 27/8درصد، 28/5درصد، 26/3درصد و 33/5درصد بود. درصد GVBDدر غلظت 6میکرومـولار نسـبت بـه دیگـر گـروههـا بیشتر بود و نسبت به غلظت 4میکرومولار افزایش آماری معنـیداری ) (P<0/055نشــان داد )نمــودار .(3میــزان بلــوغ تخمــک در گــروه کنتـرل، شـم و غلظـتهـای 1،2،4و 6میکرومـولار بـه ترتیـب 50/6 درصد، 49/4درصد، 51/6درصـد، 51درصـد، 59درصـد و 49/6 درصـد تعیـین شـد کـه در غلظـت 4میکرومـولار نسـبت بـه کنتـرل ) (P<0/04و شم ) (P<0/01اخـتلاف آمـاری معنـیداری نشـان داد. میزان بلوغ در غلظت 6میکرومولار نسبت به 4میکرومـولار افـزایش معنیداری داشت )) (P<0/02نمودار.(3 مقایسه نتایج به دست آمده از لقاح و تکوین جنینهای حاصل از تخمکهای گروه رتینوئیکاسـید نشـان داد کـه درصـد جنـینهـای 5 0 10 15 20 25 30 35 control shem Melatonin 100nM Melatonin 1µM Melatonin 2µM درصد 2 cells 4 cells 8 cells murola blast *# £€ 0 10 20 30 40 50 60 70 control shem Melatonin 100nM Melatonin 1µM Melatonin 2µM درصد GV GVBD MII Deg *# / 50اثر توأم ملاتونین و آل- ترانس رتینوئیکاسید بر بلوغ، لقاح و تکوین رویانی تخمکهای نارس موش مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی گرگان / پاییز / 1394دوره / 17شماره ) 3پی در پی (55 نمودار : 3مقایسه نسبت تخمکهای باقیمانده در مرحله ، GVدرصد تخمکهای ،GVBDدرصد بلوغ تخمک و درصد تخمکهای دژنره شده موش در گروههای کنترل، شم و غلظتهای مختلف رتینوئیکاسید * اختلاف با گروه کنترل ) #،(P<0/04اختلاف با گروه شم (P<0/055) 6 µM و4 µM(،£ اختلاف بینP<0/01) (P<0/02) 6 µM و4 µM€ اختلاف بین نمودار : 4مقایسه نسبت جنینهای مرحله 2سلولی، مرحله کلیواژ و بلاستوسیست در گروه رتینوئیکاسید نسبت به گروه کنترل و شم * اختلاف با گروه کنترل )(P<0/04 # اختلاف با گروه شم )(P<0/002 مرحلـه 2سـلولی در غلظـتهـای 1و 2و 6میکرومـولار نسـبت بـه 4میکرومولارکمتر و نسبت به کنتـرل و شـم بـهطـور غیـرمعنـیداری بیشتر است. درصد کلیواژ در غلظتهای مختلف بـا گـروه کنتـرل و شـــم اخـــتلاف آمـــاری معنـــیداری نداشـــتند. همچنـــین درصـــد بلاستوسیست در غلظت 4میکرومولار نسـبت بـه سـایر غلظـتهـای رتینوئیکاسید معنیدار نبود؛ امـا در مقایسـه بـا کنتـرل ) (P<0/04و شم ) (P<0/002افزایش آماری معنیداری نشان داد )نمودار.(4 بلوغ تخمک و تکوین در گروههای توأم از مجموع 1188تخمک نارس بهدست آمده، میزان تخمکهای باقیمانده در مرحله GVدر گروه کنترل، شـم و تـوأم 3و تـوأم 4بـه ترتیب 9/4درصد، 9/6درصد، 8/6درصد و 10/1درصـد بـود کـه در مقایسه با گروه کنترل و شم در گـروه تـوأم 3کمتـر و در گـروه توأم 4بهطور غیرمعنیداری بیشتر بود. درصد تخمـکهـای GVBD در گروه کنترل، شم، توأم 3و توأم 4به ترتیب 28/3درصـد، 28/7 درصــد، 25/5درصــد و 23/7درصــد بــود کــه اخــتلاف آمــاری معنیداری نداشتند. میزان بلوغ تخمک در گروههای کنترل، شم و تـوأم 3و تـوأم 4 به ترتیب 50/6درصـد، 49/4درصـد، 60/4درصـد و 54/2درصـد بــود کــه در گــروه تــوأم 3نســبت بــه کنتــرل ) (P<0/01و شــم ) (P<0/008افزایش آماری معنیداری نشان داد؛ اما در گروه توأم 4 اخــتلاف آمــاری معنــیداری مشــاهده نشــد. همچنــین درصــد تخمکهای دژنره شده در گروه توأم 3نسبت بـه کنتـرل )(P<0/01 و شم ) (P<0/006کاهش آماری معنیدار داشت و در گروه تـوأم 4 اختلاف آماری معنیداری مشاهده نشد )نمودار.(5 نمودار : 5مقایسه نسبت تخمکهای باقیمانده در مرحله ، GVدرصد تخمکهای ،GVBDدرصد بلوغ تخمک و درصد تخمکهای دژنره شده موش در گروههای کنترل، شم و 2گروه توام )µM،2µM Mel 4RA (RA4µM وMel100nM) ( * اختلاف با گروه کنترل ) #،(P<0/01اختلاف با گروه شم ) £،(P<0/008اختلاف با گروه شم ) €،(P<0/006اختلاف بین توام (P<0/007) (RA µM4 وMel nM100) ( وµM RA4،µM Mel2) نمودار : 6مقایسه نسبت جنینهای مرحله 2سلولی، مرحله کلیواژ و بلاستوسیست در 2گروه توام ) (4µM RA،2µM Melو )100nM Melو (4RA µMنسبت به گروه کنترل و شم * اختلاف با گروه کنترل ) #،(P<0/01اختلاف با گروه شم ) £،(P<0/003اختلاف با گروه کنترل ) €،(P<0/002اختلاف با گروه شم ) ،(P<0/001اختلاف با گروه کنترل )(P<0/005 اختلاف با گروه شم )(P<0/0001 نتـایج بـه دسـت آمـده از لقـاح وتکـوین جنـینهـای حاصـل از تخمکهایی که در معرض محیط توأم 3و 4قرار گرفتند؛ نشـان داد درصد جنینهای مرحله 2سلولی در گروه توأم 3نسبت به کنتـرل و شم بیشتر است که این اختلاف از نظر آماری معنـیدار نبـود؛ امـا در گروه توأم 4نسبت به کنتـرل ) (P<0/01و شـم ) (P<0/003افـزایش 5 0 10 15 20 25 30 35 40 control shem Mel 2µM, RA 4µM Mel 100nM, RA 4µM درصد 2 cells 4 cells 8 cells murola blast *# €£ 5 0 10 15 20 25 30 35 control shem retinoic acid 1 retinoic acid 2 retinoic acid 4 retinoic acid 6 درصد 2 cells 4 cells 8 cells murola blast *# 0 10 20 30 40 50 60 70 control shem retinoic acid 1 retinoic acid 2 retinoic acid 4 retinoic acid 6 درصد GV GVBD MII Deg € £ *# 0 10 20 30 40 50 60 70 control shem Melatonin 2µM, retinoic acid 4µM Melatonin 100nM, retinoic acid 4µM درصد GV GVBD MII Deg *# * £ €سمیه تدینی لهی و همکاران / 51 مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی گرگان / پاییز / 1394دوره / 17شماره ) 3پی در پی (55 آماری معنیداری داشت )نمودار .(6درصد کلیـواژ و بلاستوسیسـت در گروه توأم 3نسبت به کنترل و شم بـه طـور غیرمعنـیداری بیشـتر بود. این اختلاف در گروه توأم 4نسبت به کنترل ) (P<0/002و شـم ) (P<0/001افزایش آماری معنیداری داشت. درصد بلاستوسیسـت در گروه تـوأم 4نسـبت بـه کنتـرل ) (P<0/005و شـم )(P<0/0001 افزایش آماری معنیداری نشان داد )نمودار .(6 شکل : 1تخمک موش در مراحل مختلف بلوغ (Aمجموعه تخمک–کومولوس (B،400تخمک400 GV 400 MII(D،100 GVBD(C )گروه توام با غلظت Mel 2µMو(RA 4µM شکل : 2جنین موش در مراحل مختلف تکوین (Aجنینهای 2سلولی (B،200جنینهای 4سلولی200 (Cمورلا (D،200بلاستوسیست400 )گروه توام با غلظت Mel100nMو(RA 4µM بحث بــا توجــه بــه نتــایج مطالعــه حاضــر اضــافه کــردن ملاتــونین و رتینوئیکاسید هم بـه صـورت جداگانـه و هـم بـه صـورت تـوأم بـه محیط کشت بلـوغ تخمـک توانسـت سـبب افـزایش قابـل توجـه در میزان بلوغ هستهای تخمکهای نابالغ موش گردد و در ادامـه میـزان لقاح و باروری را افزایش دهـد. در گـروه ملاتـونین بـا غلظـتهـای مختلف مشخص شد میـزان بلـوغ در غلظـت 2میکرومـولار از سـایر غلظتها بیشتر بوده و نسبت به گروه کنترل و شم افزایش معنیداری داشـته اسـت. در مطالعـه بهـادری و همکـاران میـزان بلـوغ و لقـاح تخمک در محیطهای تیمار شده با دوزهـای میکرومـولار نسـبت بـه گروه کنترل افزایش معنیداری داشت؛ در صورتی که میزان تکوین جنینهـا بـا دوزهـای نـانومولار افـزایش یافـت ) .(20امـا در مطالعـه فرحور و همکاران ملاتونین نتوانست گسترش سلولهای کومولـوس و بلوغ هستهای تخمکهای گاوی را بهبود دهـد ) .(8علـت تفـاوت مطالعه حاضر با مطالعه فرحور و همکاران ) (8را میتـوان بـا بررسـی مطالعات انجام شده در این خصوص که نشان دادند میـزان موفقیـت بلوغ آزمایشگاهی وابسته به نوع گونه است و در گونههـای مختلـف متفاوت است )(10؛ جستجو کرد. یافتههای مطالعه حاضـر نشـان داد میــزان لقــاح و تکــوین در غلظــت 100نــانومولارملاتونین از ســایر غلظتها بیشتر است و نسبت به گروه کنترل افزایش معنیداری دارد که مطابق با نتایج مطالعه بهـادری و همکـاران ) (20اسـت. همچنـین اصغری و همکاران نشـان دادنـد اضـافه کـردن 10و 100نـانومولار ملاتونین به محیط کشت T 6جنین دو سلولی موش، این جنـینهـا را تا مرحله بلاستوسیست پیش میبرد و تعداد سلولهای آنها را بهطـور معنیداری افزایش میدهد ).(21 یافتههای این مطالعه در بررسی تاثیر رتینوئیکاسید به تنهـایی بـر بلــوغ و تکــوین تخمــکهــای نابــالغ نشــان داد دوزهــای 1و 2 میکرومولار در مقایسه با دوز 4میکرومولار درصد بلوغ را بـه میـزان کمتری افزایش داده و در دوز 6میکرومولار هـم میـزان بلـوغ کمتـر بود؛ اما غلظت 4میکرومولار علاوه بر بلوغ، لقاح و تکوین رویانی را تا رسیدن بـه مرحلـه بلاستوسیسـت نسـبت بـه گـروه کنتـرل بـهطـور معنیداری افـزایش داد. در مطالعـه نصـیری و همکـاران بررسـی اثـر غلظـــتهـــای مختلـــف )1،2،4،6،8میکرومـــولار( آل– تـــرانس رتینوئیکاسید بر بلوغ آزمایشگاهی تخمکهای موش نشان داد کـه میزان بلوغ تخمک بـا 2و 4میکرومـولار و میـزان لقـاح تخمـک بـا 4میکرومولار در مقایسه با کنترل بهطـور معنـیداری افـزایش یافـت ) .(18در مطالعه واحدی و همکاران روی اثـر غلظـتهـای مختلـف ) 0/5 ،1و 0/25میکرومولار( آل– ترانس رتینوئیـکاسـید بـر بلـوغ آزمایشگاهی اووسیتهای گاو، میزان بلوغ تخمک با 1میکرومولار در مقایسه با دیگر گروهها بهطور معنیداری افـزایش یافـت )(3؛ امـا در مطالعه ما غلظت 1میکرومولار اثر قابل ملاحظهای بر میزان بلـوغ نداشــت. همچنــین در مطالعــه Livingstonو همکــاران روی اثــر غلظـــتهـــای مختلـــف ) 5 ، 1و 10میکرومـــولار( آل – تـــرانس رتینوئیــکاســید بــر بلــوغ آزمایشــگاهی تخمــکهــای گــاو؛ 1میکرومــولار در مقایســه بــا کنتــرل اثــری روی بلــوغ نداشــت. 5میکرومولار در مقایسه با کنترل بـهطـور معنـیداری میـزان بلـوغ و بلاستوسیست را افزایش داد و غلظت 10میکرومـولار از نظـر میـزان / 52اثر توأم ملاتونین و آل- ترانس رتینوئیکاسید بر بلوغ، لقاح و تکوین رویانی تخمکهای نارس موش مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی گرگان / پاییز / 1394دوره / 17شماره ) 3پی در پی (55 کلیواژ و بلاستوسیست با گروه کنتـرل اخـتلاف معنـیداری نداشـت ) .(12نتــایج مطالعــه حاضــر نشــان داد میــزان لقــاح در غلظــت 4میکرومولار از بقیه بیشتر است کـه بـا مطالعـه نصـیری و همکـاران ) (18موافق است. نتایج مربوط بـه تکـوین هـم نشـان داد کـه میـزان تکوین در غلظت 4میکرومـولار از بقیـه بیشـتر اسـت کـه بـا مطالعـه Livingstonو همکــاران ) (12کــه غلظــت 5میکرومــولار را مــوثر دانســتند؛ تقریبــاً همخــوانی دارد. مطالعــه حاضــر نشــان داد اثــرات رتینوئیک اسید در بلوغ و تکوین وابسته به دوز است. بهنظر میرسـد این ماده نه در دوزهای خیلی پایین و نه خیلی بالا بلکـه در دوزهـای متوسط )4میکرومولار( میزان بلوغ و تکوین را افزایش میدهد. در گــروه 3تــوأم کــه مخلــوط غلظــتهــای مــوثر ملاتــونین )2میکرومـولار( و رتینوئیـکاسـید ) 4میکرومـولار( بـود؛ نشـان داد میزان بلوغ هم نسبت به کنترل و هم نسبت به سـایر غلظـتهـا بیشـتر است. میزان تکوین در این گروه توأم نسبت بـه گـروه کنتـرل بیشـتر بــود؛ امــا نســبت بــه غلظــت 100نــانومولار ملاتــونین و غلظــت 4میکرومولار رتینوئیک اسید که به تنهایی استفاده شدند؛ کمتر بـود. لــذا بــرای بررســی رونــد تکــوین در گــروه 4تــوأم دو غلظــت 100نانومولار ملاتونین و 4میکرومولار رتینوئیـکاسـید نشـان دادنـد میزان تکوین نسبت به گروه کنترل افزایش معنیداری داشته و نسبت به سایر غلظتهای استفاده شده به تنهایی، بیشتر است. با توجـه بـه یافتـههـای ایـن مطالعـه و مطالعـات دیگـری کـه اثـر ملاتونین و رتینوئیکاسید را مثبت ارزیابی کردهاند؛ نظرات مختلفـی در توجیه مکانیسم اثر این مواد پیشـنهاد شـده اسـت. ملاتـونین یـک پاک کننده قوی رادیکال آزاد و یـک آنتـیاکسـیدان وسـیعالطیـف محسوب میشود که در محیط کشت نه تنها منجر به لقاح مـیشـود؛ بلکه تکوین رویانی اولیه را از طریق عملـش بـه عنـوان پـاککننـده قوی رادیکال آزاد حمایت میکند ) .(6زیرا رادیکالهای آزاد سبب از کارافتـادن میتوکنـدریهـا، آسـیب DNAو RNAو پـروتئینهـا میشود ) (5و سطوح بالای ROSمیتواند به اسـپرماتوزا، تخمـک و رویـان آسـیب بزنـد و منجـر بـه بلـوک دو سـلولی در مـوش شـود )21و .(22بنــابراین ملاتــونین ممکــن اســت از طریــق از بــین بــردن رادیکالهای آزاد شرایط را برای بهبود تکوین تخمک فراهم کند و در موش از توقف در مرحله دو سلولی جلوگیری کنـد و یـا ممکـن است ملاتـونین از طریـق گیرنـدههـایش بـهطـور مسـتقیم در فعالیـت تخمدانی موثر باشد. گیرنده ملاتـونین MT1و MT2در سـلولهـای گرانولــوزای لوتئــال انســانی و در تخمــدانهــای مــوش صــحرایی )فولیکول آنترال و کورپـوس لوتئـوم( شناسـایی شـدهانـد )23و.(24 علاوه بر این ملاتونین عامـل هسـتهای (NFk-B) kappa –βرا فعـال میکند که عامل مهمی برای تکـوین رویـانی مـوش از مرحلـه یـک سلولی بـه چهارسـلولی اسـت ) .(6بنـابراین مـیتـوان ملاتـونین را بـا داشتن چنین عواملی به عنوان عامل مهمی در فراینـد بلـوغ هسـتهای، بلوغ سیتوپلاسمی تخمک و مراحـل تکـوین مطـرح کـرد. همچنـین مکانیسم اثر القای رتینوئیک اسـید در بلـوغ تخمـک و اثـرات مثبـت تکوین رویانی اولیه هنوز بهدرستی شناسایی نشده و مطالعات در این زمینـه ادامـه دارد؛ امـا بـا بررسـی زمینـهای تحقیقـات بـهعمـل آمـده تئوریهای مختلفی مطرح شده است. رتینوئیکاسید ممکن اسـت از طریق اثر روی بیان گیرنده FSHیا LHسلولهای گرانولـوزا کـه در خوک ) (12و موش صـحرایی ) (13اثبـات شـده؛ در بلـوغ تخمـک موثر باشد و یا رتینوئیکاسید از طریق افزایش پلیآدنیلاسیون سـبب افزایش کیفیت mRNAو پیشبرد بلوغ اووسیت گـردد ) .(12ممکـن است از طریق مهار سنتز نیتریک اکساید و مهارسیکلواکسی ژنـاز در رشد نهایی فولیکولهای تخمدانی موثر باشد و ممکن است از طریق شرکت در یک مکانیسم محافظتی درونی اسـترس اکسـیداتیو سـبب بلوغ تخمک شود ) .(12بنابراین رتینوئیکاسید هماننـد ملاتـونین بـا اثــرات آنتــیاکســیدانی مــیتوانــد تخمــکهــا را در برابــر عوامــل اکسیداتیو محافظت کند و منجـر بـه افـزایش کیفیـت تخمـک و در نتیجه منجر به بلوغ هستهای و سیتوپلاسمی کافی شود که ایـن خـود افـزایش لقـاح و بهبـود در مراحـل تکـوین را بـه همـراه دارد ).(18 انتخاب ملاتونین و رتینوئیکاسید با هم، به دلیـل حضـور طبیعـی در فولیکـولهـای در حـال رشـد و نیـز بـه عنـوان مـواد آنتـیاکسـیدان میتوانند از طریق گیرندههایشان در تخمکهای نابـالغ نقـش مهمـی در بلـوغ تخمـک ایفـا کننـد )7و .(12بـرای دسـتیابی محـیط کشـت مطلوب با ملاتونین و رتینوئیکاسـید بـه منظـور بلـوغ آزمایشـگاهی تخمک و تکوین رویانی اولیه و شناخت مکانیسم دقیق بررسـیهـای بیشتری پیشنهاد میشود. نتیجهگیری نتایج این مطالعه نشان داد اضـافه کـردن ملاتـونین و آل-تـرانس رتینوئیک اسید با هم به محـیط کشـت بلـوغ، سـبب افـزایش بلـوغ و بهبود تکوین جنینهای حاصله بهصورت وابسته به دوز میشود |
| نتیجه مقاله | نتایج در این تحقیق از3954 تخمک نارس موش استفاده شد(گروه کنترل 296، گروه شم 299، آزمون 1: ملاتونین در غلظت های 100nM 296، 1µM 297و 2µM 297، آزمون2: رتینوئیک اسید در غلظت های 1µM 298، 2µM 298، 4µM 300 و 6µM 298، آزمون 3:(Mel وRA) 298، آزمون 4:( Mel وRA) 295). مقایسه بین گروه کنترل و شم در تمامی مراحل بلوغ ، لقاح و تکوین نشان داد که هیچ اختلاف معنی داری بین این دو گروه وجود ندارد. در گروه ملاتونین: از مجموع 1485 تخمک نارس به دست آمده، میزان تخمک های باقیمانده در مرحله GV در گروه کنترل، شم و غلظت های100nM، 1و2 µM به ترتیب(9.4،9.6،9.1،8.4 ،8) درصد بود که نشان داد در غلظت 2µM نسبت به گروه کنترل، شم و سایر غلظت ها کمتر بود اما اختلاف معنی داری مشاهده نشد و در غلظت 100nM نسبت به سایر غلظت ها بیشتر بود ولی در مقایسه با گروه های کنترل، شم و سایر غلظت ها اختلاف معنی داری مشاهده نشد. درصد تخمک های GVBD در گروه کنترل، شم و غلظت های100nM،1و2 µM به ترتیب( 28.3،28.7،26.6،24.2،23.5) درصد بود که نتایج نشان داد در غلظت 100nM از سایر غلظت ها بیشتر بود ولی در مقایسه با گروه های کنترل، شم و سایرغلظت ها اختلاف معنی داری مشاهده نشد. میزان بلوغ تخمک در گروه کنترل، شم و غلظَت های100nM،1و2µM ملاتونین به ترتیب (50.6،49.4،54.3،54.8،59.9) درصد بود که نشان داد بلوغ تخمک در غلظت 2µM نسبت به گروه کنترل(0.02 p<)، شم (0.01p<)افزایش معنی داری مشاهده شد(نمودار1). درصد بلوغ در غلظت 100nM نسبت به گروه کنترل و شم بیشتر بود اما اختلاف معنی داری مشاهده نشد. همچنین درصد تخمک های دژنره در غلظت 2µM نسبت به گروه کنترل، شم و سایر غلظت ها کمتر بود. ولی در مقایسه با گروه های کنترل، شم و سایر غلظت ها اختلاف معنی داری مشاهده نشد. مقایسه نتایج به دست آمده از لقاح، کلیواژ و تکوین جنین های حاصل از تخمک های در معرض 100nM Mel،1 و2 µM قرار گرفته بود نشان داد که درصد جنین هایی مرحله 2سلولی و بلاستوسیست درغلظت 2µM نسبت به سایر غلظت ها کمتر بود اما نسبت به گروه کنترل و شم بیشتر بود و اختلاف معنی داری مشاهده نشد. در غلظت 100nM درصد جنین های 2سلولی در مقایسه با گروه کنترل(0.05 p<) و شم (0.02p<) افزایش معنی داری مشاهده شد(نمودار2) و درصد جنین های مرحله بلاستوسیست نسبت به گروه کنترل(0.02p<) و گروه شم(0.0001>p) افزایش معنی داری مشاهده شد ولی در مقایسه با سایر غلظت ها اختلاف معنی داری مشاهده نشد(نمودار2). همچنین در مرحله کلیواژ هیچ گونه اختلاف معنی داری در بین غلظت های مختلف با گروه کنترل و شم مشاهده نشد. در گروه رتینوئیک اسید: از مجموع 1789 تخمک نارس به دست آمده، میزان تخمک های باقیمانده در مرحله GV در گروه کنترل، شم و غلظت های(RA 1،2،4و6 µM) به ترتیب(9.4،9.6،9.3،10.7،7.3،7.7) درصد بود. که نشان داد، درصد تخمک های باقیمانده در مرحله GV در غلظت 4µM نسبت به گروه کنترل، شم و غلظت های دیگر کمتر بود و درغلظت 2µM نسبت به گروه کنترل، شم و سایر غلظت ها بیشتر بود اما اختلاف معنی داری مشاهده نشد. درصد تخمک های GVBD در گروه کنترل، شم و غلظت های مختلف RA به ترتیب (28.3،28.7 ،27.8، 28.5 ،26.3، 33.5) درصد بود. که در غلظت 4µM نسبت به گروه کنترل و شم کمتر بود اما اختلاف معنی داری مشاهده نشد. درصد تخمک های GVBD در غلظت 6µM از گروه کنترل، شم و سایر غلظت ها بیشتر بود و نسبت به غلظت 4µM افزایش معنی داری مشاهده شد(0.055>p)(نمودار3). میزان بلوغ تخمک در گروه کنترل، شم و گروه آزمون به ترتیب (50.6، 49.4، 51.6،51، 59، 49.6) درصد بود. که در غلظت 4µM نسبت به گروه کنترل(0.04>p) و شم(0.01>p) اختلاف معنی داری مشاهده شد(نمودار3). میزان بلوغ درغلظت های دیگرRA نسبت به گروه کنترل و شم بیشتر بود اما اختلاف معنی داری مشاهده نشد. مقایسه میزان بلوغ در غلظت های مختلف با یکدیگر اختلاف معنی داری را نشان نداد اما در غلظت 6µM با غلظت 4µM افزایش معنی داری مشاهده شد(0.02>p)(نمودار3). مقایسه نتایج به دست آمده از لقاح و تکوین جنین های حاصل از تخمک هایی که در معرض RA قرار گرفته بودند نشان داد که در غلظت 1µM درصد جنین هایی مرحله 2سلولی نسبت به غلظت 4µM کمتر بود اما اختلاف معنی داری مشاهده نشد. در غلظت 2µM درصد جنین های مرحله 2 سلولی نسبت به غلظت 4µM کمتر بود اما نسبت به گروه کنترل و شم بیشتر بود و اختلاف معنی داری مشاهده نشد. در غلظت 4µM درصد جنین های2 سلولی نسبت به گروه کنترل، شم و سایر غلظت ها بیشتر بود ولی اختلاف معنی داری مشاهده نشد. درغلظت 6µM درصد جنین های مرحله 2 سلولی در مقایسه با گروه کنترل و شم بیشتر بود اما نسبت به غلظت 4µM کمتر بود. به علاوه در درصد جنین های مرحله کلیواژ در غلظت های مختلف با گروه کنترل و شم اختلاف معنی داری مشاهده نشد. همچنین در غلظت4µM درصد جنین های مرحله بلاستوسیست در مقایسه با گروه کنترل(0.04>p) و شم (0.002>p)افزایش معنی داری مشاهده شد اما نسبت به سایرغلظت ها اختلاف معنی داری مشاهده نشد (نمودار4). در گروه توام (2µM Mel،4µM RA) و (100nM Mel و 4µM RA)( در مرحله بلوغ): از مجموع1188 تخمک نارس به دست آمده ، میزان تخمک های باقیمانده در مرحله GV در گروه کنترل، شم و توام با غلظت(2µM Mel،4µM RA) و توام باغلظت(100nM Mel و 4µM RA) به ترتیب (9.4،9.6،8.6،10.1) درصد بود که در گروه توام با غلظت(2µM Mel،4µM RA) نسبت به گروه کنترل وشم کمتر بود و در گروه توام با غلظت(100nM Mel و 4µM RA) نسبت به گروه کنترل وشم بیشتر بود اما اختلاف معنی داری مشاهده نشد. درصد تخمک های GVBD در گروه کنترل، شم، توام با غلظت(2µM Mel،4µM RA) و توام باغلظت(100nM Mel و 4µM RA) به ترتیب(28.3،28.7،25.5،23.7) درصد بود که نشان داد در گروه شم از بقیه گروه ها بیشتر بود اما اختلاف معنی داری مشاهده نشد. میزان بلوغ تخمک در گروه کنترل، شم و2 گروه توام با غلظت (2µM Mel،4µM RA) و (100nM Mel و 4µM RA) به ترتیب(50.6،49.4،60.4،54.2) درصد بود. که در گروه توام با غلظت(2µM Mel،4µM RA)نسبت به گروه کنترل(0.01>p) و شم(0.008>p) افزایش معنی داری نشان داد(نمودار5). و در گروه توام با غلظت(100nM Mel و 4µM RA)نسبت به گروه کنترل، شم و سایر گروه ها افزایش معنی داری مشاهده نشد. همچنین درصد تخمک های دژنره در گروه توام با غلظت(2µMMel،4µMRA) نسبت به گروه کنترل(0.01>p) و شم(0.006>p) کاهش معنی داری نشان داد(نمودار5). همچنین درصد تخمک های دژنره در گروه توام با غلظت (100nM Mel و 4µM RA) نسبت به گروه کنترل و شم و سایر غلظت ها اختلاف معنی داری نداشت اما مقایسه درصد تخمک های دژنره در گروه توام با غلظت (100nM Mel و 4µM RA) با گروه توام با غلظت (2µM Mel،4µM RA)افزایش معنی داری مشاهده شد(0.007 p<)(نمودار5). گروه توام (2µM Mel،4µM RA) و (100nM Mel و 4µM RA)( در مرحله تکوین): نتایج به دست آمده از لقاح وتکوین جنین های حاصل از تخمک هایی که در معرض محیط توام(2µM Mel،4µM RA) و (100nM Mel و 4µM RA) قرار گرفته بودند نشان داد که درصد جنین هایی مرحله 2 سلولی در گروه توام با غلظت(2µM Mel،4µM RA) نسبت به گروه کنترل و شم بیشتر بود اما اختلاف معنی داری مشاهده نشد و در گروه توام با غلظت(100nM Mel و 4µM RA) نسبت به گروه کنترل(0.01 p<) و شم (0.003 p<)افزایش معنی داری مشاهده شد(نمودار6). اما نسبت به غلظت(2µM Mel،4µM RA) بیشتر بود اما اختلاف معنی داری مشاهده نشد. در گروه توام با غلظت(2µM Mel،4µM RA)، درصد جنین هایی مرحله کلیواژ و بلاستوسیست نسبت به گروه کنترل و شم بیشتر بود اما اختلاف معنی داری مشاهده نشد. در گروه توام با غلظت(100nM Mel و 4µM RA) درصد جنین های مرحله کلیواژ(مرحله مرولا)نسبت به گروه کنترل(0.002 p<) و شم(0.001 p<) افزایش معنی داری مشاهده شد. در گروه توام با غلظت(100nM Mel و 4µM RA) درصد جنین های مرحله بلاستوسیست هم در گروه کنترل و هم در گروه شم افزایش معنی داری مشاهده شد(0.005 p<)( 0.0001 p<)(نمودار6). |
| نام فایل | تاریخ درج فایل | اندازه فایل | دانلود |
|---|---|---|---|
| st6.pdf | 1403/12/20 | 1913625 | دانلود |
| st4.pdf | 1403/12/20 | 788011 | دانلود |
